還在為NGS miRNA文庫構(gòu)建的漫長手動(dòng)操作和潛在人為誤差煩惱嗎？Opentrons Flex? 自動(dòng)化移液工作站攜手QIAGEN QIAseq? miRNA 文庫試劑盒，帶來全新的自動(dòng)化解決方案！最新應(yīng)用筆記證實(shí)，F(xiàn)lex 自動(dòng)化移液工作站不僅能很好地復(fù)現(xiàn)手動(dòng)操作的高質(zhì)量文庫，更將人工操作時(shí)間從2小時(shí)大幅縮減至僅10分鐘，顯著提升實(shí)驗(yàn)效率和標(biāo)準(zhǔn)化水平。本期文章將帶大家了解這一高效工作流程如何賦能您的 miRNA 研究！

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站

關(guān)鍵特性
Key features

自動(dòng)化性能匹配：在 Opentrons Flex 工作站上自動(dòng)化運(yùn)行 QIAGEN 的 QIAseq miRNA 文庫試劑盒，可產(chǎn)生與手動(dòng)制備相媲美的高質(zhì)量 miRNA 文庫。
操作效率提升：自動(dòng)化將人工操作點(diǎn)從六處減少至一 處，并節(jié)省約 2 小時(shí)的手動(dòng)操作時(shí)間。
文庫質(zhì)控優(yōu)化：使用 QIAseq Normalizer Kit 進(jìn)行自動(dòng)化文庫均一化，相較于基于 qPCR 的均一化方法，可將文庫質(zhì)控時(shí)間額外縮短1至2小時(shí)，手動(dòng)操作時(shí)間減少1小時(shí)20分鐘。

1 實(shí)驗(yàn)方法

樣本：使用100 ng Human XpressRef Universal Total RNA（QIAGEN，貨號(hào) 338112）制備 miRNA 測序文庫。
miRNA 測序文庫制備： 分別通過手動(dòng)方法和 Flex 自動(dòng)化方法，使用 QIAGEN QIAseq miRNA 文庫試劑盒（QIAGEN，貨號(hào) 331505）制備 miRNA 測序文庫。手動(dòng)文庫制備嚴(yán)格遵循制造商提供的操作流程。Opentrons Flex 自動(dòng)化操作采用端到端的1天工作流程，可處理8至48個(gè)樣本（圖 1）。
文庫均一化：采用 QIAGEN QIAseq Normalizer Kit（QIAGEN，貨號(hào) 180615），工作流程A（圖 2），將文庫均一化至4 nM。
質(zhì)量控制：使用Agilent Tapestation? High Sensitivity D1000 Screentape 檢測 miRNA 文庫質(zhì)量及片段大小分布。
測序：文庫在 Illumina MiSeq? 測序儀上進(jìn)行雙端讀長75 bp（2x75）測序。
數(shù)據(jù)分析：使用 QIAGEN GeneGlobe miRNA 分析流程對 FASTQ 文件進(jìn)行分析。

圖 1：在 Opentrons Flex 上實(shí)現(xiàn) QIAGEN QIAseq miRNA 文庫試劑盒工作流程全自動(dòng)化，可將人工操作時(shí)間減少近2小時(shí)
時(shí)間估算基于16個(gè)樣本的通量。深藍(lán)色：人工操作時(shí)間；淺藍(lán)色：儀器運(yùn)行時(shí)間。

圖 2. 相較于基于 qPCR 的均一化方法，使用 QIAseq Normalizer 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化均一化可使總時(shí)間減少約2小時(shí)，人工操作時(shí)間減少1小時(shí)20分鐘。
時(shí)間估算基于8個(gè)樣本通量；深藍(lán)色：人工操作時(shí)間；淺藍(lán)色：儀器運(yùn)行時(shí)間

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)展示

 在 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站上使用 QIAGEN QIAseq miRNA 文庫試劑盒制備的文庫，經(jīng) TapeStation HS D1000 分析確認(rèn)文庫片段大小及質(zhì)量（圖 3）。樣本峰強(qiáng)度位于 ~200 bp，與預(yù)期文庫大小吻合。

圖 3. 均一化前 miRNA 文庫的片段大小分布。制備的文庫呈現(xiàn)約200 bp的預(yù)期大小，未見接頭二聚體存在證據(jù)。

對均一化后的文庫進(jìn)行測序后，我們檢測了通過 Flex 自動(dòng)化移液工作站制備的16個(gè)樣本的質(zhì)量控制指標(biāo)，包括 UMI 讀段總數(shù)、注釋 UMI 讀段百分比及 UMI 讀段 Q 值（表1）。Flex 制備的樣本平均產(chǎn)生約 500 萬 UMI 讀段，其中 79% 的 UMI 讀段可映射至 miRNA 序列數(shù)據(jù)庫 miRBase。 UMI 讀段的平均 Q 值為 43，表明堿基識(shí)別準(zhǔn)確率超過 99.99%。分析發(fā)現(xiàn)， Flex 制備樣本的注釋 UMI 讀段百分比與 QIAGEN 提供的參考數(shù)據(jù)及同實(shí)驗(yàn)室手動(dòng)制備結(jié)果相當(dāng)。這些結(jié)果表明，自動(dòng)化流程構(gòu)建的文庫具備高質(zhì)量測序特性。

表1. 制備的miRNA文庫質(zhì)量控制摘要

結(jié)論

本研究展示了在 Opentrons Flex NGS 工作站上實(shí)現(xiàn) QIAseq miRNA 文庫試劑盒全自動(dòng)化制備的方法。自動(dòng)化構(gòu)建的文庫質(zhì)量優(yōu)異，與手動(dòng)方法性能相當(dāng)，同時(shí)顯著減少人工操作時(shí)間及操作節(jié)點(diǎn)。進(jìn)一步結(jié)合 QIAseq Normalizer 的自動(dòng)化文庫均一化模塊，文庫制備與均一化的總時(shí)長縮短約2小時(shí)，節(jié)省人工操作時(shí)間逾3小時(shí)。該方案使得 NGS 技術(shù)人員可在8小時(shí)工作日內(nèi)完成文庫制備，其中人工操作時(shí)間僅需20分鐘。最終獲得的4 nM 雙鏈 DNA 文庫可直接用于混合測序或低溫存儲(chǔ)。

當(dāng)前方案雖基于48樣本通量設(shè)計(jì)，但 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站兼容標(biāo)準(zhǔn)96孔板格式，單次運(yùn)行可自動(dòng)化處理多達(dá)96個(gè)樣本。這種通量提升對生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等大樣本量研究至關(guān)重要。