作者
林喬納森1瑞恩薩薩達(dá)1，杰薩里雷德2，霍馬姆賈馬爾2，金納里沃森21Zymo研究2Optrens實(shí)驗(yàn)室公司。

摘要
微生物學(xué)是一個(gè)具有重要意義的新興領(lǐng)域?yàn)槿祟惤】档膹V泛的主題?，F(xiàn)代的測序技術(shù)可以提供豐富和新穎的數(shù)據(jù)但受到DNA提取方法的限制，這困難、耗時(shí)，特別是在微生物方面樣本，容易產(chǎn)生偏差。自動(dòng)化系統(tǒng)可以解決其中一些挑戰(zhàn)，但必須小心設(shè)計(jì)和校準(zhǔn)，并需要配合適當(dāng)?shù)脑噭﹣硖峁└哔|(zhì)量的結(jié)果。
在目前的一套測試中，視中心子采用OT-2核酸提取工作站ZymoBIOMICSTM 96磁珠DNA試劑盒從典型的微生物樣本中提取DNA。表演對該系統(tǒng)和試劑盒的產(chǎn)量和純度指標(biāo)進(jìn)行了評估。提取偏倚和交叉污染分別是也評估。結(jié)果表明，OT-2結(jié)合在一起使用ZymoBIOMICS試劑盒生產(chǎn)了高產(chǎn)、高純度的DNA樣品，沒有偏倚和交叉污染。確定了若干項(xiàng)調(diào)整以進(jìn)一步改進(jìn)表演總之，這些測試?yán)C了OT-2在不同應(yīng)用程序?qū)崿F(xiàn)過程中的準(zhǔn)確性和精度，提供了最佳的性能行業(yè)領(lǐng)先的微生物學(xué)DNA提取試劑盒。

介紹
人類的微生物群已不再處于生物學(xué)研究的背景。多樣，大，和微生物群非?；钴S，已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，它因其在人類健康方面的廣泛作用而日益受到重視，包括傳染病、晝夜節(jié)律和心理狀況的作用。自動(dòng)化可以支持這一新興領(lǐng)域在關(guān)鍵的核酸提取步驟中具有無偏置性能的領(lǐng)域。
優(yōu)質(zhì)的DNA提取依賴于有效的溶解，即特別是對微生物組樣本的挑戰(zhàn)性它們所含的各種生物體。一些生物更耐寒，更耐溶解，而其他的更容易溶解，更容易溶解。如果一種裂解法不能克服這些差異，耐寒的物種將會(huì)產(chǎn)生更少的DNA，而更易感的物種會(huì)產(chǎn)生更多，導(dǎo)致下游分析中有偏倚代表性。

通常使用兩種主要裂解法：酶法或基于試劑的裂解和機(jī)械裂解。這個(gè)在ZymoBIOMICS 96磁珠DNA試劑盒中使用基于珠技術(shù)的機(jī)械裂解試劑盒使用超高密度，混蛋珠tm來傳遞微生物的均勻溶解并與自動(dòng)化，因?yàn)橹樽邮穷A(yù)裝在準(zhǔn)備樣品的管。

自動(dòng)化為DNA提供了進(jìn)一步的改進(jìn)提取除了裂解的挑戰(zhàn)，手工DNA提取協(xié)議是耗時(shí)且容易產(chǎn)生的由錯(cuò)誤和差異引起的可變性實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的性能。自動(dòng)化程序可以消除可變性和增加吞吐量，但必須小心校準(zhǔn)，以確保DNA被分離出來產(chǎn)量和純度都很好。

本研究試圖評估OT-2核酸提取自動(dòng)工作站與ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA的性能微生物學(xué)試劑盒。測定了收率和純度在典型的微生物學(xué)糞便樣本中使用標(biāo)準(zhǔn)提取性能指標(biāo)。這些指標(biāo)是比較了自動(dòng)工作站和由訓(xùn)練有素的手工程序技術(shù)人員對自動(dòng)化工作站也進(jìn)行了測試用于板井間的交叉污染。

該測試旨在優(yōu)化該試劑盒和系統(tǒng)的方案。
OT-2避免了提取偏倚，并交付的樣品的產(chǎn)率和純度與由訓(xùn)練有素的技術(shù)人員執(zhí)行的手工程序相當(dāng)。橫井污染程度在兩者之間也具有可比性。兩種提取方法。此外，一些協(xié)議使用OT-2自動(dòng)化工作流程進(jìn)行了調(diào)整，以提高產(chǎn)量和減少周轉(zhuǎn)時(shí)間。

結(jié)果
使用OT-2工作站和ZymoBIOMICS MagBead試劑盒自動(dòng)提取DNA，成功地純化了DNA，沒有引入偏倚純化偏倚可能是由于不均勻的裂解之間造成的一個(gè)樣本中的微生物群物種。有些物種較少易于溶解，因此可能被代表不足在下游測序數(shù)據(jù)中?；斓爸閆ymoBIOMICS試劑盒中使用的技術(shù)是一種通過珠磨機(jī)或珠磨機(jī)進(jìn)行機(jī)械分解的系統(tǒng)跳動(dòng)的技術(shù)。這種技術(shù)包括將樣品與小玻璃、鋼或陶瓷珠結(jié)合起來用力混合兩者。1在混合過程中，珠子與細(xì)胞發(fā)生碰撞，打破細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，釋放DNA。打珠試劑使用超高密度珠子可以以這種方式均勻地溶解微生物樣品，防止偏倚。

為了評估這種性能，我們使用OT-2工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA提取DNA試劑盒對酶ZymoBIOMICS的樣品進(jìn)行了檢測微生物群落標(biāo)準(zhǔn)（N=8）。提取的DNA用16S rRNA基因靶向測序進(jìn)行分析，引物針對V3-V4區(qū)域伊利諾斯州的測序?MiSeq?儀器。微生物群落標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)明確的特征參考樣品的種類包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及酵母菌不同的大小和細(xì)胞壁組成。由偏置裂解法產(chǎn)生的觀察到的組成不能反映標(biāo)準(zhǔn)品的理論組成。測序數(shù)據(jù)顯示，使用OT-2核酸提取工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA試劑盒進(jìn)行自動(dòng)提取，并觀察到高保真度符合微生物群落標(biāo)準(zhǔn)的微生物圖譜（圖1）。

試劑盒自動(dòng)化提供了收率和純度匹配的手動(dòng)提取OT-2核酸提取物的性能工作站與酶微生物學(xué)96 MagBead從典型微生物糞便樣本中提取DNA的DNA試劑盒進(jìn)行DNA產(chǎn)量和純度評估，并與經(jīng)過高度訓(xùn)練有素的技術(shù)人員執(zhí)行的手工程序進(jìn)行比較（N=12）。采用納米Drop2000紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行測量DNA濃度和吸光度比（A260/230、A260/280）。

手動(dòng)和自動(dòng)化的程序交付在附近相同的結(jié)果（圖2）。自動(dòng)化和手動(dòng)操作該程序的平均產(chǎn)率為57.88ng/μLand 57.85ng/μL，平均吸光度值為260/2801.94和1.90，平均吸光度值為260/230分別為1.85和1.87。自動(dòng)化程序避免了交叉污染板井之間的交叉污染存在aDNA提取程序的重大問題，因?yàn)楸晃廴镜臉颖緯?huì)損害數(shù)據(jù)的完整性。然而，污染可能很難預(yù)防手工處理程序相比之下，自動(dòng)化可以減少污染，促進(jìn)審計(jì)程序如果污染確實(shí)發(fā)生了，它將會(huì)被識別出來。向評估OT-2核酸提取工作站對于交叉污染，新型隱球菌和將酶微生物學(xué)DNase/Fre-rnase水加入a96孔板，交替使用，棋盤式使用。平板用自動(dòng)工作站進(jìn)行處理，每個(gè)孔的洗脫液用Femto進(jìn)行qPCR檢測tmCFX96上的細(xì)菌DNA定量試劑盒。

觸摸實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)在任何充滿水的對照井中檢測到新生兒，這表明沒有發(fā)生交叉污染（圖3）。

圖2：自動(dòng)化和人工程序提供了相當(dāng)?shù)腄NA產(chǎn)量和純度。用OT-2核酸提取工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA試劑盒從糞便樣本中提取DNA。用ng/μL法測定純化后的DNA的產(chǎn)量和純度，和260/280和使用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度法獲得的260/230的吸光度值，在收率(A)和純度（B和C）方面得到了幾乎相同的結(jié)果。

結(jié)論
對DNA提取方法的評價(jià)OT-2核酸提取工作站與之配套ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA試劑盒顯示沒有凈化偏差。自動(dòng)提取提供的產(chǎn)率和純度與訓(xùn)練有素的技術(shù)人員的手工提取相當(dāng)，同時(shí)避免了井間的交叉污染。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些協(xié)議調(diào)整，以提高提取工作流程的性能和速度。

采用OT-2核酸提取工作站和ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA試劑盒提取DNA，獲得高純度DNA，收率高凈化偏倚或交叉污染。優(yōu)秀

沒有污染或純化偏差的性能是必要的DNA提取協(xié)議保持。隨著微生物學(xué)研究的不斷發(fā)展。這些高性能的結(jié)果表明，OT-2可以為微生物的工作流程提供一個(gè)可靠的純化解決方案。這些數(shù)據(jù)還展示了OT-2對支持廣泛應(yīng)用程序的工具包的使用的靈活性。OT-2可以提供增加的吞吐量和減少的周轉(zhuǎn)時(shí)間，以促進(jìn)更雄心勃勃的實(shí)驗(yàn)，節(jié)省寶貴的時(shí)間，同時(shí)保持高質(zhì)量數(shù)據(jù)的高標(biāo)準(zhǔn)。