作者
Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

應(yīng)用概述
酶免疫分析 (EIA) 或酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 是液體樣本中檢測目標(biāo)分子(例如抗原)的常用分析工具，通常用于免疫診斷 或研究。該測定一般采用96 孔板格式，并且工作流程通常包括 試劑轉(zhuǎn)移和混合，以及一些在恒定溫度下的孵育和洗滌步驟。這 些步驟均要求樣本處理高度一致性。為了實(shí)現(xiàn)自動化，我們使用 OT-2 自動化移液工作站搭配熱振蕩儀研發(fā)并測試了 ELISA 全自 動化的方案，該方案使用 Takara Bio 公司的夾心法 EIA 試劑盒 檢測人類纖連蛋白(FN),Tecan 的競爭法 ELISA 試劑盒檢測 唾液中的皮質(zhì)醇，以及 Cell Sciences 的另一種競爭法 ELISA 試劑盒用于定量血清樣本中的中和SARS-CoV-2 抗體。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
配備8通道移液器和熱振蕩儀的 OT-2 移液工作站具備高精度自動化完成 ELISA的能力。
在更高的吞吐量設(shè)置中，該協(xié)議可以用最少的操作時(shí)間處理多達(dá)96個樣本。

應(yīng)用介紹
酶免疫分析 (EIAs) 或酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISAs) 是一種通過 高度特異的抗體-抗原的相互作用對液體樣本的目標(biāo)分子(例如 抗原)進(jìn)行檢測和定量的技術(shù)。這種測定通常在96孔或384孔 板上進(jìn)行，我們把抗原固定在孔板上，可以通過直接將抗原連接 到固體表面或使用預(yù)涂在固體表面的捕獲抗體來實(shí)現(xiàn)。通過這個過程，它能夠?qū)⒖乖c樣本中其他非靶向分子分離開來。

夾心法 ELISA是該測定方法中最常用的形式。常規(guī)步驟如下：
1、如果供應(yīng)商未提供預(yù)涂該抗體的孔板，我們則需要將捕獲抗體(即與目標(biāo)物特異結(jié)合的抗體)通過被動吸附的方式固定在孔板 上(例如，8孔或12孔條紋組裝在與96孔微孔板讀取器兼容的框架上)。
2、將待分析的樣品加入到涂有抗體的板上，使目標(biāo)抗原被捕獲。
3、將固定的目標(biāo)抗原暴露給與酶(例如辣根過氧化物酶或HRP)偶聯(lián)的檢測抗體。
4、加入酶的底物，以產(chǎn)生可以測量和定量的信號。

人源纖維連接蛋白(FN)EIA試劑盒 (Takara Bio,美國加利福尼 亞州圣何塞)是一種體外定量測定血清、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的試劑盒。該試劑盒提供了足夠的試劑和材料，可用于在 OT-2 平臺上進(jìn)行 EIA協(xié)議的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證。

FN 廣泛分布在細(xì)胞表面、細(xì)胞外基質(zhì)和血漿中，參與細(xì)胞基質(zhì)粘 附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控以及其他細(xì)胞功能。Takara 公司 的 FN EIA試劑盒采用兩種抗人源 FN 的鼠單克隆抗體，形成抗體- 抗原-抗體夾心復(fù)合物：捕獲抗體預(yù)涂在含8連管，檢測抗體與過 氧化物酶結(jié)合。通過將此復(fù)合物暴露于過氧化物酶的底物中，可 以產(chǎn)生光度信號，其吸光度與樣品中目標(biāo)物(即人源 FN) 的數(shù)量成正比。

競爭法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 過 檢測信號干擾來測量抗原的濃度。簡而言之，目標(biāo)抗原與預(yù)涂在 孔板上的參照物(抗原)競爭與酶偶聯(lián)抗體結(jié)合。樣品中目標(biāo)抗 原的濃度越高，參考抗原與抗體結(jié)合的能力就越弱，產(chǎn)生的信號 就越弱。 一些競爭法 ELISA 試劑盒，如次本研究中測試的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗體攜帶，而是由參照 物攜帶，參照物與目標(biāo)抗原競爭與抗原-抗體作用。我們在 OT-2 上進(jìn)行測試另一個的 ELISA 試劑是 Cell Sciences 公司(美國馬 薩諸塞州紐伯里港)的 SARS-CoV-2 替代病毒中和檢測試劑盒， 用于測量 SARS-CoV-2 感染后或?qū)σ呙缃臃N產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體。中和抗體通過阻斷盤狀病毒融合蛋白的受體結(jié)合域 (recep-tor-binding domain,RBD) 與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 結(jié)合，抑制 SARS-CoV-2 進(jìn) 入細(xì)胞。該試劑盒提供預(yù)涂的病毒棘蛋白RBD板，以競爭法ELISA 的形式，引入HRP- 偶聯(lián)的ACE2 與中和抗體競爭捕獲RBD。

雖然 ELISA 的設(shè)計(jì)方法有很多，但萬變不離其宗，他們都遵循相似的工作流程。ELISA 的常規(guī)操作步驟包括試劑移液、孵育以及反復(fù)洗滌，這些步驟可以在 OT-2 上輕松完成。在每個試劑步驟之間會進(jìn)行連續(xù)的洗滌，以去除未結(jié)合的分子。為了防止剩余的溶液帶到下一個試劑步驟中，把過量的液體全部吸走非常重要。Opentrons的8通道移液器可進(jìn)行高效、精準(zhǔn)的移液處理，以滿足 ELISA 中試劑移液和洗滌的需求。此外，可以通過添加 Opentrons 溫控模塊或熱振蕩儀，以提升自動化功能和滿足實(shí)驗(yàn)中的樣品孵育環(huán)節(jié)(例如設(shè)定為37℃以促進(jìn)抗原-抗體相互作用)所需的恒溫功能。

材料和方法
圖1-3顯示了在 Opentrons OT-2 上測試的三種 ELISA 的示意圖，包括試驗(yàn)步驟概述和甲板布局。

液體轉(zhuǎn)移是通過8通道移液器進(jìn)行的。ELISA 孔板使用了一個帶 有裂縫密封的封膜 (BioChromato, 日本藤澤),這樣移液器 的吸頭可以穿過封膜，同時(shí)在孵育期間防止蒸發(fā)。然后，ELISA 板被固定在熱振蕩儀上，并按照說明書的要求提供熱力和攪拌 作用(參考表1)。在完成實(shí)驗(yàn)后，需要立即手動將 ELISA 孔板移至酶標(biāo)儀，并在450 nm 波長處測量吸光度值。

為了測試 FN EIA 試劑盒，首先將人血漿中的 FN 溶解在去離子水中，制備出1 mg/mL 的儲備溶液，然后進(jìn)一步稀釋至500 ng/mL 并進(jìn)行2倍的連續(xù)稀釋。而對于皮質(zhì)醇 ELISA 測試，則 使用試劑盒提供的已知皮質(zhì)醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和控制液。之前已 經(jīng)測試過 SARS-CoV-2 抗體陽性或陰性的血清樣本將被用于病 毒中和 ELISA 實(shí)驗(yàn)。每個實(shí)驗(yàn)在不同樣本量下的運(yùn)行時(shí)間是可預(yù)估的(參考表1)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
將 FN EIAs 在 OT-2 上進(jìn)行處理?？梢酝ㄟ^評估最終讀數(shù)與目標(biāo)分子濃度之間的相關(guān)性以及不同實(shí)驗(yàn)之間這種相關(guān)性的一致性來評估樣本處理質(zhì)量。通過繪制平均吸光度 (n=3)與 FN 濃度之間的關(guān)系圖，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以確定線性回歸的擬合優(yōu)度。

結(jié)果展現(xiàn)了 OT-2 在執(zhí)行該試劑盒的實(shí)驗(yàn)中的準(zhǔn)確性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (圖4A), 和重復(fù)性(圖4B)。使用皮質(zhì)醇的連續(xù)稀釋來測試OT-2上的競爭法 ELISA 。結(jié)果顯示液體處理的一致性 (n=3,CV<10%),在半對數(shù)圖上呈現(xiàn)了試驗(yàn)讀數(shù)與對數(shù)轉(zhuǎn)換后的樣品濃度之間的優(yōu)秀負(fù)線性關(guān)聯(lián) (R 平方>0 .99) ( 圖5A), 并且實(shí)驗(yàn)之間具有可重復(fù)性(圖5C)。

為了檢測競爭法 ELISA 中 ACE2-RBD 結(jié)合的抑制作用，血清樣本 在 OT-2 上進(jìn)行了三次處理，在酶標(biāo)儀上測量吸光度，并獲得了變異系數(shù)。結(jié)果再次確認(rèn)了 OT-2 液體處理的精確性 (CV<10%)(圖6)。根據(jù)廠家的說明書，該實(shí)驗(yàn)是有效的，因?yàn)槊總€控制組 的 OD450 值都在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(陽性對照<0.3,陰性對照>0.9)。抑制率的計(jì)算公式如下：

該實(shí)驗(yàn)成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2抗體陽性的樣本中能夠中和 ACE2-RBD 相互作用的抗體(表格1)。

實(shí)驗(yàn)總結(jié)
通過使用 OT-2 進(jìn)行競爭性 ELISA和中和抗體檢測，我們得出結(jié)論：
1、在 OT-2 上進(jìn)行的稀釋處理和吸光度測量顯示了高度一致的結(jié)果，證實(shí)了 OT-2 液體處理的精確性和可重復(fù)性。
2、根據(jù)廠家說明書的要求，實(shí)驗(yàn)的對照組的 OD450 值都在有效范圍內(nèi)，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的有效性。
3、利用實(shí)驗(yàn)測量的抑制率，成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2 抗體陽性的樣本中存在的中和抗體。
4、表格2中的人體血清樣本確認(rèn)為陽性，進(jìn)一步證實(shí)了其先前 ELISA檢測的結(jié)果。
綜上所述，該實(shí)驗(yàn)在檢測中和抗體方面表現(xiàn)出優(yōu)越的精確性和可靠性 ，OT-2 的樣品處理能力足以與傳統(tǒng)手動方法相媲美。