作者
Boren Lin,PhD,Kinnari Watson,PhD

應用概述
酶免疫分析 (EIA) 或酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 是液體樣本中檢測目標分子(例如抗原)的常用分析工具，通常用于免疫診斷 或研究。該測定一般采用96 孔板格式，并且工作流程通常包括 試劑轉(zhuǎn)移和混合，以及一些在恒定溫度下的孵育和洗滌步驟。這 些步驟均要求樣本處理高度一致性。為了實現(xiàn)自動化，我們使用 OT-2 自動化移液工作站搭配熱振蕩儀研發(fā)并測試了 ELISA 全自 動化的方案，該方案使用 Takara Bio 公司的夾心法 EIA 試劑盒 檢測人類纖連蛋白(FN),Tecan 的競爭法 ELISA 試劑盒檢測 唾液中的皮質(zhì)醇，以及 Cell Sciences 的另一種競爭法 ELISA 試劑盒用于定量血清樣本中的中和SARS-CoV-2 抗體。

關鍵發(fā)現(xiàn)
配備8通道移液器和熱振蕩儀的 OT-2 移液工作站具備高精度自動化完成 ELISA的能力。
在更高的吞吐量設置中，該協(xié)議可以用最少的操作時間處理多達96個樣本。

應用介紹
酶免疫分析 (EIAs) 或酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISAs) 是一種通過 高度特異的抗體-抗原的相互作用對液體樣本的目標分子(例如 抗原)進行檢測和定量的技術(shù)。這種測定通常在96孔或384孔 板上進行，我們把抗原固定在孔板上，可以通過直接將抗原連接 到固體表面或使用預涂在固體表面的捕獲抗體來實現(xiàn)。通過這個過程，它能夠?qū)⒖乖c樣本中其他非靶向分子分離開來。

夾心法 ELISA是該測定方法中最常用的形式。常規(guī)步驟如下：
1、如果供應商未提供預涂該抗體的孔板，我們則需要將捕獲抗體(即與目標物特異結(jié)合的抗體)通過被動吸附的方式固定在孔板 上(例如，8孔或12孔條紋組裝在與96孔微孔板讀取器兼容的框架上)。
2、將待分析的樣品加入到涂有抗體的板上，使目標抗原被捕獲。
3、將固定的目標抗原暴露給與酶(例如辣根過氧化物酶或HRP)偶聯(lián)的檢測抗體。
4、加入酶的底物，以產(chǎn)生可以測量和定量的信號。

人源纖維連接蛋白(FN)EIA試劑盒 (Takara Bio,美國加利福尼 亞州圣何塞)是一種體外定量測定血清、尿液、細胞培養(yǎng)上清液 和其他生物液中可溶性人源 FN 的試劑盒。該試劑盒提供了足夠的試劑和材料，可用于在 OT-2 平臺上進行 EIA協(xié)議的設計和驗證。

FN 廣泛分布在細胞表面、細胞外基質(zhì)和血漿中，參與細胞基質(zhì)粘 附、細胞遷移、細胞形態(tài)的調(diào)控以及其他細胞功能。Takara 公司 的 FN EIA試劑盒采用兩種抗人源 FN 的鼠單克隆抗體，形成抗體- 抗原-抗體夾心復合物：捕獲抗體預涂在含8連管，檢測抗體與過 氧化物酶結(jié)合。通過將此復合物暴露于過氧化物酶的底物中，可 以產(chǎn)生光度信號，其吸光度與樣品中目標物(即人源 FN) 的數(shù)量成正比。

競爭法 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 通 過 檢測信號干擾來測量抗原的濃度。簡而言之，目標抗原與預涂在 孔板上的參照物(抗原)競爭與酶偶聯(lián)抗體結(jié)合。樣品中目標抗 原的濃度越高，參考抗原與抗體結(jié)合的能力就越弱，產(chǎn)生的信號 就越弱。 一些競爭法 ELISA 試劑盒，如次本研究中測試的 Tecan 公司的 Cortisol Saliva ELISA, 酶不是由抗體攜帶，而是由參照 物攜帶，參照物與目標抗原競爭與抗原-抗體作用。我們在 OT-2 上進行測試另一個的 ELISA 試劑是 Cell Sciences 公司(美國馬 薩諸塞州紐伯里港)的 SARS-CoV-2 替代病毒中和檢測試劑盒， 用于測量 SARS-CoV-2 感染后或?qū)σ呙缃臃N產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體。中和抗體通過阻斷盤狀病毒融合蛋白的受體結(jié)合域 (recep-tor-binding domain,RBD) 與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (angioten-sin converting enzyme 2,ACE2) 結(jié)合，抑制 SARS-CoV-2 進 入細胞。該試劑盒提供預涂的病毒棘蛋白RBD板，以競爭法ELISA 的形式，引入HRP- 偶聯(lián)的ACE2 與中和抗體競爭捕獲RBD。

雖然 ELISA 的設計方法有很多，但萬變不離其宗，他們都遵循相似的工作流程。ELISA 的常規(guī)操作步驟包括試劑移液、孵育以及反復洗滌，這些步驟可以在 OT-2 上輕松完成。在每個試劑步驟之間會進行連續(xù)的洗滌，以去除未結(jié)合的分子。為了防止剩余的溶液帶到下一個試劑步驟中，把過量的液體全部吸走非常重要。Opentrons的8通道移液器可進行高效、精準的移液處理，以滿足 ELISA 中試劑移液和洗滌的需求。此外，可以通過添加 Opentrons 溫控模塊或熱振蕩儀，以提升自動化功能和滿足實驗中的樣品孵育環(huán)節(jié)(例如設定為37℃以促進抗原-抗體相互作用)所需的恒溫功能。

材料和方法
圖1-3顯示了在 Opentrons OT-2 上測試的三種 ELISA 的示意圖，包括試驗步驟概述和甲板布局。

液體轉(zhuǎn)移是通過8通道移液器進行的。ELISA 孔板使用了一個帶 有裂縫密封的封膜 (BioChromato, 日本藤澤),這樣移液器 的吸頭可以穿過封膜，同時在孵育期間防止蒸發(fā)。然后，ELISA 板被固定在熱振蕩儀上，并按照說明書的要求提供熱力和攪拌 作用(參考表1)。在完成實驗后，需要立即手動將 ELISA 孔板移至酶標儀，并在450 nm 波長處測量吸光度值。

為了測試 FN EIA 試劑盒，首先將人血漿中的 FN 溶解在去離子水中，制備出1 mg/mL 的儲備溶液，然后進一步稀釋至500 ng/mL 并進行2倍的連續(xù)稀釋。而對于皮質(zhì)醇 ELISA 測試，則 使用試劑盒提供的已知皮質(zhì)醇濃度的標準品和控制液。之前已 經(jīng)測試過 SARS-CoV-2 抗體陽性或陰性的血清樣本將被用于病 毒中和 ELISA 實驗。每個實驗在不同樣本量下的運行時間是可預估的(參考表1)。

實驗結(jié)果
將 FN EIAs 在 OT-2 上進行處理。可以通過評估最終讀數(shù)與目標分子濃度之間的相關性以及不同實驗之間這種相關性的一致性來評估樣本處理質(zhì)量。通過繪制平均吸光度 (n=3)與 FN 濃度之間的關系圖，并計算標準偏差，可以確定線性回歸的擬合優(yōu)度。

結(jié)果展現(xiàn)了 OT-2 在執(zhí)行該試劑盒的實驗中的準確性和精密度(R平方>0.99,CV<10%) (圖4A), 和重復性(圖4B)。使用皮質(zhì)醇的連續(xù)稀釋來測試OT-2上的競爭法 ELISA 。結(jié)果顯示液體處理的一致性 (n=3,CV<10%),在半對數(shù)圖上呈現(xiàn)了試驗讀數(shù)與對數(shù)轉(zhuǎn)換后的樣品濃度之間的優(yōu)秀負線性關聯(lián) (R 平方>0 .99) ( 圖5A), 并且實驗之間具有可重復性(圖5C)。

為了檢測競爭法 ELISA 中 ACE2-RBD 結(jié)合的抑制作用，血清樣本 在 OT-2 上進行了三次處理，在酶標儀上測量吸光度，并獲得了變異系數(shù)。結(jié)果再次確認了 OT-2 液體處理的精確性 (CV<10%)(圖6)。根據(jù)廠家的說明書，該實驗是有效的，因為每個控制組 的 OD450 值都在標準范圍內(nèi)(陽性對照<0.3,陰性對照>0.9)。抑制率的計算公式如下：

該實驗成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2抗體陽性的樣本中能夠中和 ACE2-RBD 相互作用的抗體(表格1)。

實驗總結(jié)
通過使用 OT-2 進行競爭性 ELISA和中和抗體檢測，我們得出結(jié)論：
1、在 OT-2 上進行的稀釋處理和吸光度測量顯示了高度一致的結(jié)果，證實了 OT-2 液體處理的精確性和可重復性。
2、根據(jù)廠家說明書的要求，實驗的對照組的 OD450 值都在有效范圍內(nèi)，驗證了實驗的有效性。
3、利用實驗測量的抑制率，成功檢測到先前被診斷為SARS-CoV-2 抗體陽性的樣本中存在的中和抗體。
4、表格2中的人體血清樣本確認為陽性，進一步證實了其先前 ELISA檢測的結(jié)果。
綜上所述，該實驗在檢測中和抗體方面表現(xiàn)出優(yōu)越的精確性和可靠性 ，OT-2 的樣品處理能力足以與傳統(tǒng)手動方法相媲美。