下一代測(cè)序（NGS）文庫(kù)制備是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，涵蓋 DNA 片段化、末端修復(fù)、接頭添加以及 PCR 擴(kuò)增等多個(gè)關(guān)鍵步驟。這一系列步驟中還穿插著多個(gè)純化環(huán)節(jié)，要求用戶在各個(gè)孵育階段之間頻繁進(jìn)行操作，這無(wú)疑增加了實(shí)驗(yàn)的繁瑣度和時(shí)間成本。

為了簡(jiǎn)化這一流程，提升實(shí)驗(yàn)效率，我們?cè)诖伪狙芯恐薪榻B了一種在 Opentrons Flex 平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)的自動(dòng)化協(xié)議。該協(xié)議使用 Twist Library Preparation Enzymatic Fragmenta-tion (EF)Kit 2.0和Twist Universal Adapters System 制備可用于測(cè)序的文庫(kù)。通過(guò)在一個(gè)協(xié)議中實(shí)現(xiàn)整個(gè)文庫(kù)制備流程的自動(dòng)化，用戶可以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中節(jié)省時(shí)間，專注于其他任務(wù)。

Opentrons Flex NGS 工作站

方法

1、酶促片段化和文庫(kù)制備
在本研究中，我們使用50 ng的Promega人類男性基因組DNA作為起始材料，通過(guò)Twist Library Preparation Enzymatic Fragmentation (EF) Kit 2.0實(shí)現(xiàn)了96個(gè)樣品的DNA片段化。隨后，利用Twist Universal Adapters System的TruSeq Compatible 96樣品板A添加接頭，并通過(guò)UDI引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成文庫(kù)構(gòu)建。整個(gè)自動(dòng)化流程在Opentrons Flex NGS工作站上執(zhí)行，遵循Opentrons在線協(xié)議庫(kù)中的相關(guān)協(xié)議（DOC-001239 REV 6.0）。

2、DNA文庫(kù)分析
文庫(kù)制備完成后，使用Agilent 4150 TapeStation配合High Sensitivity D1000 Reagents及High Sensitivity D1000 ScreenTape對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行了質(zhì)量分析，同時(shí)使用Qubit? 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit和Qubit? 4熒光計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行了精確的定量分析。

結(jié)果

在應(yīng)用Twist Bioscience Library Preparation EF 2.0 with Enzymatic Fragmentation and Twist Universal Adapters System協(xié)議后，成功在Opentrons Flex平臺(tái)上自動(dòng)化完成了8個(gè)樣品的DNA片段化和文庫(kù)制備，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)2小時(shí)40分鐘。在自動(dòng)化流程開始前，僅需約30分鐘進(jìn)行桌面布局和試劑樣品準(zhǔn)備。隨著樣本數(shù)量的增加，自動(dòng)化文庫(kù)制備時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，16個(gè)樣本耗時(shí)3小時(shí)，24個(gè)樣本耗時(shí)3小時(shí)30分鐘，這反映了自動(dòng)化平臺(tái)處理更多樣本時(shí)的合理時(shí)間增長(zhǎng)。與手動(dòng)操作相比，自動(dòng)化流程顯著提高了效率和準(zhǔn)確性。

圖 1：全自動(dòng)化 Twist BioScience Library Preparation EF 2.0 工作流程減少了約 67% 的手動(dòng)操作時(shí)間（樣本數(shù)量為 8 個(gè)）

在文庫(kù)制備完成后，我們對(duì)8個(gè)樣品的產(chǎn)量和片段大小進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示片段主要集中在300-500 bp范圍內(nèi)，符合預(yù)期。定量分析得出，文庫(kù)的平均濃度為71.6 ng/μL，平均片段大小為328.1 bp，這些數(shù)據(jù)證明了自動(dòng)化流程能夠高效生成高質(zhì)量的測(cè)序文庫(kù)。

圖2. 高產(chǎn)出以及長(zhǎng)度均一的人類基因組 DNA 文庫(kù)
數(shù)據(jù)為 8 個(gè) Promega 人類男性基因組 DNA 樣本，投入量為 50ng

結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，科學(xué)家只需花費(fèi) 30 分鐘進(jìn)行桌面設(shè)置和試劑準(zhǔn)備，隨后整個(gè)流程即可在 Opentrons Flex 平臺(tái)上自動(dòng)運(yùn)行，無(wú)需額外人工干預(yù)。該高度自動(dòng)化的流程顯著提高了實(shí)驗(yàn)效率，減少了人為操作的誤差，提升了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。處理 8-24 個(gè)樣本時(shí)，從準(zhǔn)備到完成的運(yùn)行時(shí)間僅為 3-3.5 小時(shí)，幫助科學(xué)家在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣本，為大規(guī)模測(cè)序項(xiàng)目的快速推進(jìn)提供了有力支持。
Opentrons Flex 與 Twist EF 2.0 文庫(kù)制備工作流程的結(jié)合為 NGS 文庫(kù)制備帶來(lái)了革命性的變革。這一創(chuàng)新技術(shù)不僅提高了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性，還為生命科學(xué)研究的深入發(fā)展提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。未來(lái)，隨著自動(dòng)化技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，我們有理由相信，NGS 文庫(kù)制備的自動(dòng)化程度將進(jìn)一步提升，為生命科學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)更多驚喜和突破。