樣品中目標(biāo)蛋白的純化與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基石。蛋白質(zhì)分離后，總蛋白的濃度定量與均一化處理可為后續(xù)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析的樣品酶解及純化步驟建立基準(zhǔn)（圖1）。使用自動(dòng)化設(shè)備完成這些必要步驟中的重復(fù)移液操作，可顯著提升實(shí)驗(yàn)通量并為研究人員節(jié)省寶貴時(shí)間。本研究作為自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)完整工作流程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站的兩套流程，實(shí)現(xiàn)了已純化的單克隆抗體的自動(dòng)化定量與均一化處理。

圖 1. Opentrons Flex 自動(dòng)化樣品制備工作流程示意圖。

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站

1 實(shí)驗(yàn)方法
使用兩個(gè)公開(kāi)的運(yùn)行程序自動(dòng)執(zhí)行單克隆抗體樣品的定量和均一化（圖2）。將從三種細(xì)胞培養(yǎng)物中收集的純化單克隆抗體（六個(gè)復(fù)孔）、兩倍稀釋的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品以及 BCA 試劑（Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scienti?c, Waltham, MA）手動(dòng)加載到 Opentrons Flex 平臺(tái)上。工作站執(zhí)行了 BCA 工作液的制備以及工作液與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的混合（每個(gè)反應(yīng)200 μL工作液 + 25 μL樣 品/標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在熱振蕩模塊上進(jìn)行短暫振蕩并在37°C孵育30分鐘。然后通過(guò)板式吸光度讀數(shù)器模塊在562 nm處測(cè)量吸光度。生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并估算三種純化單克隆抗體的濃度（圖3）。

蛋白質(zhì)濃度定量與均一化處理 - 第一部分：
Pierce BCA 蛋白濃度檢測(cè)

圖 2.Opentrons Flex 自動(dòng)化蛋白質(zhì)定量和均一化的甲板布局示意圖。
板位 C2 - Corning 96 孔平底板 360 μL或類(lèi)似耗材
板位 D2 - Corning 96 孔平底板 360 μL或類(lèi)似耗材的板蓋?
板位 D1 - 熱振蕩模塊（搭配通用平底適配器）
板位 C1 - Opentrons 24 孔離心管架（搭配 NEST 1.5 mL 離心管，最多 24 個(gè)樣品）或 NEST 96 孔深孔板（2 mL）
板位 B1 - Opentrons 24 孔離心管架（搭配 NEST 1.5 mL 離心管）（若樣本數(shù) > 24）
板位 A1 - Opentrons 24 孔離心管架（搭配 NEST 1.5 mL 離心管）或 Opentrons Tough 96 孔全裙邊PCR板（200 μL）或 NEST 96 孔深孔板（2 mL）
板位 A2 - Opentrons 10 孔離心管架（搭配 NEST 4×50 mL 及 6×15 mL 離心管）?
板位 C3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（50 μL）
板位 B3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（1000 μL）?
板位 D3 – 板式吸光度讀數(shù)器模塊

蛋白質(zhì)濃度定量與均一化處理 - 第二部分：
均一化樣本制備

板位 C2 - Opentrons Tough 96 孔全裙邊PCR板（200 μL）
板位 C1 - Opentrons 24 孔離心管架（搭配 NEST 1.5 mL 離心管（最多 24 個(gè)樣品） 或 NEST 96 孔深孔板（2 mL）
板位 B1 - Opentrons 24 孔離心管架（搭配 NEST 1.5 mL 離心管）（若樣本數(shù) > 24）?
板位 A2 - Opentrons 10 孔離心管架（搭配 NEST 4×50 mL 及 6×15 mL 離心管）
板位 C3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（50 μL）
板位 B3 - Opentrons Flex 96 孔濾芯吸頭盒（200 μL）

Figure 3.通過(guò)BCA法蛋白濃度檢測(cè)估算純化產(chǎn)物中的IgG濃度。
實(shí)驗(yàn)首先采用牛血清白蛋白（BSA）在PBS或洗脫緩沖液中進(jìn)行連續(xù)兩倍梯度稀釋?zhuān)ㄗ髨D，起始濃度：2000 μg/mL, n=4）以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后將各樣本的吸光度值擬合至該標(biāo)準(zhǔn)曲線（右圖，n=6）
均一化流程計(jì)算了樣本與稀釋液（100 mM碳酸氫銨）所需體積，并通過(guò)移液制備含有均一濃度單克隆抗體（100 ng/μL）的新微孔板。

結(jié)論

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站及其公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方案，能夠自動(dòng)化完成蛋白質(zhì)定量（如 BCA 檢測(cè)）與均一化處理，從而將目標(biāo)蛋白稀釋至所需濃度。該自動(dòng)化方法為常規(guī)實(shí)驗(yàn)任務(wù)提供了便捷的解決方案，既有助于減少人力需求，也能將其整合到基于 LC-MS 的蛋白質(zhì)組學(xué)分析工作流程中。