在單克隆抗體（mAb）制備領(lǐng)域，相較于傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，基因工程表達(dá)載體在復(fù)制具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性的分子級(jí)抗體方面展現(xiàn)出更高效的優(yōu)勢(shì)。特別是在研發(fā)的早期階段，能夠自動(dòng)化生產(chǎn)用于臨床前研究的治療性 mAb 候選物（例如，具有修飾可變區(qū)的全長(zhǎng) IgG），已引起研發(fā)人員的極大興趣。

基于以上背景，Opentrons 應(yīng)用科學(xué)家 Boren Lin 博士和 Kinnari Watson 博士，測(cè)試并驗(yàn)證了 Opentrons 自動(dòng)化移液工作站 OT-2 和 Flex 在這一流程中的應(yīng)用。

方法

蛋白表達(dá)流程

平臺(tái)：Opentrons OT-2（配備 HEPA 模塊）
工作流程
第 1 天：在 6 孔板中準(zhǔn)備 HeLa 細(xì)胞（37°C 和 5% CO₂，懸浮培養(yǎng)）
第 2 天：準(zhǔn)備 DNA /轉(zhuǎn)染試劑混合物（Thermo Scientific, Waltham, MA 的 pRABBIT IgG IRES-EmGFP 陽(yáng)性對(duì)照載體，和 Promega, Madison, WI 的 FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑），并將上述混合物加入 HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)物中（37°C 和 5% CO₂，懸浮培養(yǎng)）
第 5 天：收集培養(yǎng)基（將收集的產(chǎn)物進(jìn)行蛋白純化）

蛋白純化流程

平臺(tái)：Opentrons Flex（配備加熱振蕩模塊和磁力模塊）
工作流程
1. 用平衡緩沖液對(duì)Dynabeads Protein G（Thermo Scientific, Waltham, MA）進(jìn)行預(yù)處理
2. 孵育并混勻樣品/磁珠混合物以捕獲目標(biāo)蛋白（持續(xù)混勻 2 小時(shí)）
3. 洗滌 2 次
4. 洗脫目標(biāo)蛋白
最終產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE、Western Blot 和蛋白定量檢測(cè)

蛋白定量檢測(cè)流程

平臺(tái)：Opentrons Flex（配備溫控模塊）
工作流程
1. 準(zhǔn)備工作試劑（Thermo Scientific, Waltham, MA 的 BCA 蛋白測(cè)定試劑）
2. 將工作試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入 96 孔板中用以準(zhǔn)備工作板
3. 孵育（37°C，30 分鐘）
通過(guò)在平臺(tái)外的讀數(shù)器上測(cè)量 560 nm 的吸光度獲得讀數(shù)，并通過(guò)參照標(biāo)準(zhǔn)曲線估算蛋白水平。

蛋白消化和純化流程

平臺(tái)：Opentrons Flex（配備熱循環(huán)模塊）
工作流程
1. 還原：在37°C下使用DTT處理30分鐘
2. 烷基化：在室溫下使用IAA處理30分鐘
3. 消化：在37°C下使用胰蛋白酶處理16小時(shí)
4. 純化：使用SP3方法對(duì)消化后的樣品進(jìn)行脫鹽處理，該過(guò)程采用Sera-Mag SpeedBead羧基化修飾磁珠（Cytiva，Marlborough, MA）
5. 收集洗脫液并進(jìn)行真空干燥（平臺(tái)外操作）
最終產(chǎn)品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析。

流程腳本在開(kāi)放源代碼的 Opentrons Protocol 協(xié)議庫(kù)中提供：
細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備（最多 4 塊板）
DNA 轉(zhuǎn)染（最多 4 塊板）
用于免疫沉淀的 Dynabeads
用于免疫沉淀的 Dynabeads---15 mL 試管中的試劑
BCA 蛋白測(cè)定

結(jié)果

通過(guò) OT-2 平臺(tái)上的自動(dòng)化蛋白表達(dá)流程轉(zhuǎn)染載有 IgG cDNA 的 HeLa 細(xì)胞，并通過(guò)熒光顯微鏡觀察到 GFP 表達(dá)確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功 (圖 1)。

圖 1：HeLa 細(xì)胞在 6 孔板中以 70% 匯合度接種，然后培養(yǎng)過(guò)夜。每孔的轉(zhuǎn)染 Master Mix 通過(guò)將 DNA（2 μg）與 FuGene 轉(zhuǎn)染試劑（6 μL）混合在無(wú)血清的 DMEM（100 μL）中制備。室溫孵育 10 分鐘后，在配備 HEPA 模塊的 OT-2 上運(yùn)行蛋白表達(dá)流程。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng) 72 小時(shí)，并使用 EVOS M7000（Thermo Scientific，Waltham，MA）拍攝圖像，并收獲培養(yǎng)基。

通過(guò) Flex 平臺(tái)上的自動(dòng)化蛋白純化流程處理從轉(zhuǎn)染的 HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲的上清液以收集分泌的 IgG，并通過(guò) SDS-PAGE 和 Western Blot 確認(rèn)純化的 IgG (圖 2)。

圖 2：轉(zhuǎn)染 72 小時(shí)后收集的培養(yǎng)基在 Flex 上使用 Dynabeads Protein G 進(jìn)行 IgG 分離，并將洗脫產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE 和 Western Blot 分析。上圖：純化與未純化培養(yǎng)基；下圖：使用IRDye^? 680RD Goat anti-Rabbit IgG (LI-COR Biosciences，Lincoln，NE) 檢測(cè)到的兔 IgG。

通過(guò) Flex 平臺(tái)上的自動(dòng)化蛋白定量流程對(duì)最終產(chǎn)物中純化后的 IgG 進(jìn)行 BCA 蛋白檢測(cè) (圖 3)。

圖 3：使用 PBS 或者其他用于蛋白純化后洗脫的緩沖液，對(duì) BSA（起始濃度: 200 ug/mL）進(jìn)行 2 倍梯度稀釋，各個(gè)梯度取 25 ul 進(jìn)行 BCA 測(cè)定。用讀扳機(jī)測(cè)定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；?n = 4 獲得的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（左圖）。通過(guò)蛋白純化流程收集的洗脫產(chǎn)物進(jìn)行了 BCA 蛋白測(cè)定，并估算蛋白濃度?；?n = 6 獲得的均值和變異系數(shù)（右圖）。

通過(guò)蛋白消化和純化流程處理的樣品顯示良好的基峰離子色譜圖。所有肽樣品中均檢測(cè)到兔 IgG (圖 4) 

圖 4：已純化的 6 個(gè)兔 IgG 樣品在紐約市立大學(xué)高級(jí)科學(xué)研究中心（紐約，NY）通過(guò) Bruker’s maXis-II ETD ESI-QqTOF/Dionex Ultimate-3000 液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。（上圖）基峰強(qiáng)度色譜圖（離子電流 vs. 保留時(shí)間）和（下圖）檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。

結(jié)論

在本研究中，我們成功利用 Opentrons 自動(dòng)化移液工作站，通過(guò)一系列自動(dòng)化策略優(yōu)化了重組單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 包括蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、定量分析以及蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的制備。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅驗(yàn)證了自動(dòng)化流程的可行性，還顯著減少了手動(dòng)操作時(shí)間，并展示了其在高通量樣品制備方面的潛力。