DNA測序作為生命科學(xué)研究的核心工具，其數(shù)據(jù)質(zhì)量高度依賴于精準(zhǔn)的DNA片段化處理。傳統(tǒng)方法常需依賴高成本的專用設(shè)備且操作流程復(fù)雜。本應(yīng)用筆記詳細(xì)闡述了如何利用 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站實(shí)現(xiàn)移液剪切技術(shù)的自動(dòng)化操作，以滿足 PacBio 測序?qū)?DNA 片段的特定需求。

Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站

本應(yīng)用筆記系統(tǒng)闡述了通過移液剪切技術(shù)實(shí)現(xiàn)高分子量（HMW）DNA定向片段化的標(biāo)準(zhǔn)化流程，所生成的DNA片段符合PacBio?長讀長文庫制備的尺寸要求。該方法對起始材料具有廣泛兼容性，可基于完整HMW DNA或部分降解DNA樣本實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可重復(fù)的片段化效果。

1 實(shí)驗(yàn)方法

樣本制備:
使用 Nanobind HMW DNA 提取試劑盒（PacBio，產(chǎn)品編號：103-? ?260-000）從血液中分離出高分子量 DNA。從 NA12878 細(xì)胞系中提 取降解的 DNA 作為另一組起始材料。
DNA 片段化：
采用 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站執(zhí)行移液剪切操作。將 DNA稀釋于 LTE 緩沖液（PacBio，產(chǎn)品編號：103-228-900）中，并置于 Nest 2 mL 深孔板內(nèi)（Opentrons，產(chǎn)品編號：999-00103）。根據(jù)表 1 所示條件進(jìn)行剪切操作。

表 1. 移液剪切條件

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)展示

采用 Femto Pulse（Agilent，產(chǎn)品編號：M5330AA）儀器，并配套使用 gDNA 165kb 分析試劑盒（Agilent，產(chǎn)品編號：? FP-1002-0275） ，對剪切前后的 DNA 樣本進(jìn)行了毛細(xì)管脈沖場電泳分析。
在本次研究中，對 3μg 和 5μg 的高分子量 DNA（HMW DNA）樣本進(jìn)行了移液剪切處理，并詳細(xì)分析了剪切前后 DNA 片段的長度變化。3μg 和 5μg 的 DNA 樣本分別在 300μL 和 500μL 的 LTE 緩沖液中稀釋。
在評估 DNA 剪切質(zhì)量的過程中，重點(diǎn)關(guān)注基因組質(zhì)量數(shù)值 (GQN)，該指標(biāo)表明 DNA 的完整性，以及符合 PacBio 長讀長 DNA 片段的特定尺寸和分布要求。這些要求包括：
? 平均片段大小需位于 15-20kb 之間
? 分布范圍應(yīng)在 10-30kb 之間
? 剪切片段的大致范圍為 5-40kb

本研究中使用的完整 HMW DNA 樣本在 30 kb 閾值下的 GQN 分別為 8（3 μg 樣本）和 8.8（5 μg 樣本）。剪切后的 DNA 符合上述所有要求，表明移液剪切技術(shù)可以提供適合 PacBio 測序的 DNA 片段（圖 1）。

(A）3 μg HMW DNA，剪切前后對比

(B）5 μg HMW DNA，剪切前后對比

圖 1. 剪切前后高分子量（HMW）DNA 的情況

(A) 剪切前（黑色）和剪切后（藍(lán)色）的 3 μg 高分子量 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小為 18,337 bp。
(B) 剪切前（黑色）和剪切后（藍(lán)色）的 5 μg 高分子量 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小為 17,665 bp。

考慮到 DNA 樣本往往源自質(zhì)量不佳的材料，這些材料中的 DNA 在剪切處理前可能已經(jīng)發(fā)生了一定程度的降解。例如，來自福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織的 DNA 就常常面臨這樣的問題。
為確認(rèn)移液剪切是否適用于這些情況，我們分析了降解 DNA 的表現(xiàn)，分別使用 3 μg 和 5 μg 樣本，且兩者在 30 kb 閾值下的 GQN（基因組質(zhì)量數(shù)值）為 4.5。這些樣本的剪切結(jié)果同樣滿足文庫構(gòu)建所需的片段大小質(zhì)量控制要求（圖 2）。

A）3μg 降解 DNA，剪切前后對比

B）5μg 降解 DNA，剪切前后對比

圖 2. 剪切前后的降解基因組 DNA
(A) 剪切前（黑色）和剪切后（藍(lán)色）的 3 μg 降解 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小為 15,751 bp。
(B) 剪切前（黑色）和剪切后（藍(lán)色）的 5 μg 降解 DNA。剪切后的 DNA 平均片段大小為 15,916 bp。

圖2.轉(zhuǎn)錄本和基因檢測敏感度。
A)每個(gè)細(xì)胞中檢測到的轉(zhuǎn)錄本:顯示在不同測序深度下，PBMC(外周血單核細(xì)胞)中每個(gè)細(xì)胞檢測到的轉(zhuǎn)錄本的中位數(shù)。
B)每個(gè)細(xì)胞中檢測到的基因:顯示在不同測序深度下，PBMC 中每個(gè)細(xì)胞檢測到的基因的中位數(shù)。

結(jié)論

研究數(shù)據(jù)表明，基于Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站的自動(dòng)化DNA移液剪切技術(shù)不僅能夠適配完整的高分子量（HMW）DNA樣本，同時(shí)對已發(fā)生降解的DNA樣本（如FFPE來源樣本）亦展現(xiàn)出穩(wěn)定處理能力。經(jīng)剪切后的DNA片段在平均大?。?5-20 kb）及分布范圍（10-30 kb）上均符合 PacBio? 長讀長測序的文庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。基于此，自動(dòng)化移液剪切技術(shù)可作為傳統(tǒng)機(jī)械剪切方法（如超聲、霧化等）的可靠替代方案，為PacBio測序的文庫制備提供標(biāo)準(zhǔn)化、可擴(kuò)展的高效路徑。