隨著測序項目的不斷擴展和測序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，為了節(jié)省寶貴的時間和減少人力資源的消耗,實驗室對于簡化文庫制備流程的需求日益迫切。

現(xiàn)今，自動化文庫制備流程已經(jīng)成為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)的有效策略。文庫制備的化學(xué)方法，例如支持自動化、縮短工作流程以及減少移液步驟等特點也大幅提升了文庫制備過程的效率。

在本文中，我們將詳細介紹如何通過 Opentrons Flex平臺，結(jié)合 QIAseq^? FX DNA Library Kit 與 QIAseq^? Normalizer Kit 實現(xiàn)自動化文庫制備，從而更高效地為大腸桿菌、人類基因組以及混合微生物 DNA 制備文庫。

重點與概述

使用 Opentrons Flex 移液工作站，結(jié)合 QIAseq^? FX DNA Library Kit 和 QIAseq^? Normalizer Kit 進行自動化操作，能夠高效地完成 96 個樣本的文庫制備流程，整個過程僅需 4 - 5 小時，所需手動操作時間不到 1 小時。

該工作流程結(jié)束后，我們得到了濃度為 4nM 的、高度均一、標準化的高通量全基因組測序（WGS）文庫。

為了應(yīng)對日益增長的測序需求，越來越多實驗室正逐步引入自動化技術(shù)。然而，對于許多實驗室而言，自動化是一項重大投資，并且還需要考慮與使用的化學(xué)試劑的兼容性、處理樣品的通量、整體工作流程的優(yōu)化以及需要手動操作的時間等因素。

在本研究中，我們采用了一套自動化的文庫制備流程，成功地制備了大腸桿菌 （E.coli） 、人類基因組以及混合微生物的 DNA 文庫，并在 Opentrons Flex 自動化移液工作站上實現(xiàn)了文庫的標準化處理，單次處理樣本量高達 96 個。

QIAseq^? FX DNA Library Kit 通過酶促片段化法和 UDI （雙唯一標簽法）簡化了 NGS 文庫制備步驟。使用 QIAseq^? FX DNA Library Kit 將文庫標準化至 4nM，無需 qPCR 定量，進一步簡化工作流程。

Opentrons Flex 自動化移液平臺配備了 Flex 移液器和相應(yīng)的耗材，以及多種模塊，如熱循環(huán)模塊、溫度模塊、熱振蕩模塊和環(huán)形磁力架，多元模塊協(xié)作運行，使得樣本處理的通量高達 96 個。

材料與方法

樣本

三種全基因組測序文庫：(1)大腸桿菌(2)混合微生物群落和(3)人類(更多詳細信息請參閱表 1)。

文庫制備和標準化

在 Opentrons Flex 上使用 QIAseq^? FX DNA Library Kit 工作流程制備全基因組文庫(參閱表 1、表 2)。使用 QIAseq^? Library Normalizer Kit 工作流程 A 和 B 進行文庫標準化。

質(zhì)控

測序之前，在 Agilent Tapestation High Sensitivity D1000 Screentape 上測定文庫的片段大小和濃度，并使用 KAPA Library Quantification kit 進行 qPCR 定量。然后將樣品變性、稀釋，準備上機測序。

測序

標準化的混合文庫在 Illumina MiSeq^? (2 x 150 bp) 和 NextSeq^? ( 2 x 75 bp ) 上進行測序。

數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)去重后，將其上傳至 Galaxy 平臺。在 Galaxy 中 使 用 fastp 對雙端數(shù)據(jù)進行分析 ，然后使用 BWA-mem 進行基因組比對。最后，使用 Samtools 分析比對后的數(shù)據(jù)。

應(yīng)用實驗結(jié)果

圖 1 . QIA seq 工作流程初始甲板布局：兩個 Flex 8 通道移液器、 Flex 轉(zhuǎn)板抓手和放置在甲板上的模塊。

圖 2 . 在 Opentrons Flex 上自動化 QIAseq^? FX DNA Library Kit 和 QIAseq^? Normalizer Kit 工作流程，可以將總體工作流程時間縮短數(shù)小時，并將實際操作時間縮短至不到 1 小時。時間是基于 96 個樣本通量的預(yù)估值。

Opentrons Flex NGS 工作站的應(yīng)用，使得 QIAseq^? FX DNA Library Kit 和 QIAseq^? Normalizer Kit 的自動化操作成為可能。實驗室可以根據(jù)自身樣本處理量的需求，選擇兩種不同的移液器配置：一種是兩個 Flex 8 通道移液器的配置，適合處理多達 48 個樣本；另一種是單個 Flex 96 通道移液器的配置，能夠應(yīng)對多達 96 個樣本的處理需求。

在處理 96 個樣本的情況下，手動操作和自動化流程所需時間的對比結(jié)果顯示：自動化流程大幅度減少了全流程所需時間和手動操作的勞動強度。

圖 3 . 以大腸桿菌基因組 DNA 制備的高產(chǎn)量和高均一性的文庫。圖中所顯示的數(shù)據(jù)是使用 8 個大腸桿菌 DNA 樣本各 100 ng 輸入量，經(jīng)過 15 分鐘的片段化和 6 個循環(huán)的擴增后， 生成的文庫數(shù)據(jù)。

圖 4 . 在混合微生物樣本中，不同 GC 含量的物種之間的群落特征比較。所顯示的數(shù)據(jù)是從 8 個 ATCCMSA-1003 樣品，使用 1 ng 輸入量，經(jīng)過 14 分鐘的片段化(含 2.5 μL FX Enhancer)、12 個循環(huán)的擴增和 1:10 的接頭稀釋而生成的。

表 5 . 從人類基因組 DNA 制備的高產(chǎn)量和均一的文庫。該組數(shù)據(jù)是使用 Promega 公司提供的 8 各男性人類基因組 DNA 樣本生成的，輸入量為 100 ng ，經(jīng)過 15 分鐘的片段化和 6 個循環(huán)的擴增。

為了驗證自動化工作流程的效能，我們制備了多種類型的全基因組測序文庫，涵蓋了大腸桿菌、人類基因組以及混合微生物樣本。

在這一過程中，我們注意到大腸桿菌的全基因組測序文庫展現(xiàn)出了較高的產(chǎn)量以及優(yōu)異的均勻性（圖3）?；旌衔⑸飿颖舅苽涞?DNA 文庫表現(xiàn)出了豐富的產(chǎn)出以及良好的均衡性，其群落特征與預(yù)期的、具有不同 GC 含量的物種的群落特征相吻合（圖4）。同樣，對于人類基因組 DNA的文庫制備，我們也獲得了較高的產(chǎn)量和良好的均勻性（表5）。

圖 5 . QIAseq^? Normalizer Kit 可以從不同輸入 DNA 濃度的樣本中產(chǎn)生重復(fù)性好、標準化的 DNA 文庫。為了證明這一點，我們使用 24個大腸桿菌 DNA 樣本，輸入量范圍從 10 到 100 ng （變異系數(shù)為 64.67% ）。我們使用 QIAseq^? FX DNA Library Kit 和 QIAseq^? Normalizer Kit（ 工作流程 B ） 處理了這些樣本，并在文庫制備后分別取出了標準化前和標準化后的等分樣本進行檢測分析。分析可知，QIAseq^? Normalizer Kit 制備的文庫濃度適合測序（平均為 1.8 ng/μl ），且文庫濃度的質(zhì)量不穩(wěn)定性下降（變異系數(shù)從 33.85% 降低到 13.53% ）。

QIAseq^? Library Normalizer Kit 替代普通耗時的文庫定量方法，簡化了文庫制備過程，所得文庫均一性好（圖 5 ）。

應(yīng)用實驗結(jié)論

在本應(yīng)用指南中，我們展示了一種自動化、超高效、簡單易用的全基因組測序（WGS）文庫制備和標準化工作流程。與手工相比，通過將自動化與 QIAseq^? FX DNA Library Kit 和 QIAseq^? Normalizer Kit 相結(jié)合，工作流程的總體和實際操作時間大大縮短。與此同時，該工作流程可以制備得到產(chǎn)量高、質(zhì)量好的文庫。