測(cè)定OT-2上THP-1細(xì)胞中過(guò)氧化氫水平的自動(dòng)化分析

瓦蘇達(dá)SNair博士. 1金納里·沃森博士11.Optrins實(shí)驗(yàn)室公司。

介紹

沙桂油過(guò)氧化氫（H2O2)主要與細(xì)胞損傷有關(guān)；然而，重新生成百美分的研究表明，細(xì)胞釋放低水平的H2O2作為正常細(xì)胞間的一部分高頻率多路通信過(guò)氧化氫的轉(zhuǎn)運(yùn)、攝取和釋放的機(jī)制生物學(xué)效應(yīng)目前還不為人所知，但對(duì)癌癥、干細(xì)胞有重要意義細(xì)胞和衰老。
雙聯(lián)體紅色試劑是非熒光的基于10-乙酰3,7二羥基苯氧惡嗪的氧化，測(cè)定原理簡(jiǎn)單它是由辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化的，在H2O2產(chǎn)生一個(gè)紅色熒光產(chǎn)物，間苯二酚，化學(xué)計(jì)量比為1：1。
樹(shù)脂最終產(chǎn)物具有較高的消光系數(shù)這是一種超靈敏的檢測(cè)方法，只有10皮摩爾的H2O2在一個(gè)100 μL的卷中；1×10–5U/mL的HRP。
這些讀數(shù)可以用分光光度法測(cè)量，也可以用熒光讀數(shù)法測(cè)量使用酶標(biāo)儀，激發(fā)530 nm，發(fā)射波590 nm。

材料和方法

OT-2，P300單GEN2移液管，P20單GEN2移液管
溫度模塊設(shè)置為23°C，在協(xié)議結(jié)束時(shí)設(shè)置為37°C。
THP-1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞（ATCC，Manassas，VA，USA）(No。TIB-202)
無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基（熱費(fèi)雪科學(xué)11835030）
佛波12-肉豆蔻酸13-醋酸酯（PMA）（Sigma Aldrich P1585-1MG）
胎牛血清（胎牛血清）未熱滅活（ATCC，Cat No. 30-2020）
Amplex紅色檢測(cè)試劑盒(Cat No.A22188)，包括a) 5X反應(yīng)緩沖液b) HRP c) DMSO d) Amplex紅色試劑e) 3% H2O2
a)視中心96過(guò)濾器尖端架200μL b)96過(guò)濾器尖端架20μL c)視中心10管架與獵鷹4 x 50 mL，6 x15mL錐形d)視中心24管架與埃彭多夫1.5 mL安全鎖扣帽（兩個(gè)）

結(jié)論

OT-2可以進(jìn)行測(cè)定H的自動(dòng)化測(cè)定2O2在THP-1細(xì)胞
OT-2可以以96孔的格式處理中等到高通量的樣本數(shù)量
OT-2可以模擬人工協(xié)議而不損失時(shí)間和高度可重復(fù)性

討論

本研究是為了了解像Amplex Red這樣自動(dòng)檢測(cè)H的可行性2O2在OT-2。H2O2被證明是一種重要的信號(hào)分子，負(fù)責(zé)代謝活性和幫助補(bǔ)酶激活，可以影響細(xì)胞形態(tài)，并在生長(zhǎng)因子的存在下導(dǎo)致增殖。細(xì)胞外的
H2O2這里使用的細(xì)胞系是人類單核細(xì)胞，THP-1。結(jié)果表明，H可能依賴于濃度2O2不同PMA環(huán)境中的生產(chǎn)速率。H的關(guān)系2O2釋放速率和PMA濃度可能是在10,25 ng/mL時(shí)比基礎(chǔ)速率顯著增加之后。OT-2已成功用于NGS、IP中的各種實(shí)驗(yàn)協(xié)議的自動(dòng)化，從而簡(jiǎn)化了標(biāo)準(zhǔn)試劑盒和分析協(xié)議的使用，可以手動(dòng)勞動(dòng)密集型。通過(guò)自動(dòng)化分析步驟，與手動(dòng)方案相比，觀察到一致的檢測(cè)性能。此外，這還描述了量化過(guò)氧化物/過(guò)氧化物酶的人工和人工方案之間的移液效率。該協(xié)議能夠給用戶一個(gè)小時(shí)的實(shí)踐時(shí)間
11分鐘，如果需要檢測(cè)多個(gè)不同細(xì)胞類型的96孔板，以檢測(cè)添加或不添加各種興奮劑或生長(zhǎng)因子的過(guò)氧化氫水平，這可能是一種有效的方法。

原文地址：OT-2 海報(bào)上 THP-1 細(xì)胞過(guò)氧化氫水平的自動(dòng)測(cè)定