應(yīng)用概述
隨著不斷進(jìn)步的技術(shù)推動，現(xiàn)代分子生物學(xué)持續(xù)取得萬眾矚目的 突破和發(fā)展，包括更大規(guī)模的研究、更強(qiáng)大的治療方法以及全新 的研究問題。然而，盡管核酸提取這項技術(shù)是分子生物學(xué)得以進(jìn) 步的一項重要且密不可分的實驗環(huán)節(jié)，科研人員仍然在沿用著幾 十年前冗長而繁瑣的程序進(jìn)行核酸提取。在這樣的困局之下，自 動化解決方案應(yīng)運而生?，F(xiàn)代自動化通過引入具備穩(wěn)定性和高效 運作優(yōu)勢的機(jī)器設(shè)備完成標(biāo)準(zhǔn)化流程高效自動運行，自動化核酸 提取將使生物實驗室舊有的工作方式迎來現(xiàn)代化。為了真正意義 上幫助科研人員達(dá)到高效研發(fā)或生產(chǎn)的目的，自動化系統(tǒng)需要達(dá) 到甚至超越高技能技術(shù)人員的表現(xiàn)，為下游工作流程提供高質(zhì)量的樣本。

本項研究旨在測試Opentrons OT-2核酸工作站作為有效自動化 磁珠基因提取工具的性能。研究中使用了幾種研究人員和臨床醫(yī) 生常用的常見模板：人類唾液、人類口腔拭子、細(xì)菌培養(yǎng)物和 RNA 病毒。同時，使用了行業(yè)中常見的主流試劑品牌。通過產(chǎn) 量、CV 值和qPCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行性能評估，實驗數(shù)據(jù)將與高技能技術(shù)人員的手動操作結(jié)果進(jìn)行比較。

經(jīng)過研究測試，OT-2 表現(xiàn)優(yōu)異。使用OT-2 進(jìn)行提取的實驗變異 性降低，同時復(fù)現(xiàn)率提高，并且能在較低的成本和更快的周轉(zhuǎn)時 間下提供了類似的產(chǎn)量。重要的是，這些性能改進(jìn)和成本節(jié)省可 以隨著吞吐量的增加而提升。因此，該測試表明，使用 OT-2 進(jìn) 行核酸提取自動化可以使實驗流程高效自動化，讓自動化核酸提取能夠滿足高端分子生物學(xué)的高性能標(biāo)準(zhǔn)。

研究材料和方法
人類唾液： 從匿名捐贈者處收集新鮮唾液并儲存在15 mL 錐形管中直至使用。

口腔拭子：使用20 mm break point (Zymo@) 口腔采集拭子對匿名 志愿者進(jìn)行采樣，并儲存于在1 mL Zymo DNA/RNA 保護(hù)液中，室溫保存運輸，

細(xì)菌培養(yǎng)： 使用 One shot°TOP10 制備感受態(tài)大腸桿菌 (Thermo Fisher Scientific*) 在37°℃,225 rpm 振蕩條件下在溶菌液中培養(yǎng)過 夜。使用前，每個樣品用2000 rpm 離心1.5 分鐘。去除上清液，沉淀物被重新懸浮于等體積的冷磷酸鹽緩沖液中。此外，對于乳酸桿菌樣品，每個樣品使用約1×107拷貝/μL的 Lactobacillus plantarum(ATCC°8014MINIPACKTM)。

病毒：由于2020年3月COVID-19 全球大流行開始(1),病毒 RNA 試劑盒中使用了的合成 SARS-COV-2 RNA Control 2(Twist Biosci- ences), 每個樣品10拷貝/μL。

內(nèi)部對照：按照 Panpradist、Nuttada 等人(2)中所述使用和創(chuàng)建合 成鼻樣基質(zhì)(SNM)。SNM 的配方為：110 mM NaCl、1%w/v來自豬 胃類型I的粘蛋白(Sigma M2378-100G)和10 μg/mL w/v 人類基 因組DNA(Coriell NA12878), 混合體積為TE/SNM的90%。每個病毒樣本使用50 pg/μL的 SNM。

試劑盒：本項研究中選擇了來自不同品牌的 DNA、RNA 和病毒 RNA提取試劑盒(參見表1)?？偣矙z驗了7個試劑品牌的13種試劑盒。

提取： 在自動化檢測之前，我們對每個 DNA 和 RNA 提取試劑及 模板進(jìn)行了手動測試，以獲取手動測試基線濃度。每個模板在每 種試劑中進(jìn)行7次重復(fù)測試，并配備1 個陰性對照樣本。本次研 究在 Opentrons 平臺上進(jìn)行了自動化核酸提取。對于 DNA 和 RNA 提取試劑，每個樣本進(jìn)行了7 次提取。對于病毒RNA 提取試 劑盒，包括了22 個帶有相同的 SARS-CoV-2 和 SNM 模板的樣 本。每個 OT-2 運行中都包括1個陰性對照樣本(nuclease-free H2O) 。OT-2 的設(shè)備裝配了 GEN2 磁珠純化模塊、p300 多通道 移液器和可選配的 GEN2 溫控模塊，對于 RNA 實驗來說，為保證 更好的實驗效果，建議配備溫控模塊。根據(jù)不同的試劑盒，需要 使用大概14盒300 μL 吸頭，1 個 NEST 的單孔儲液器，1 個NEST 2 mL深孔板，2個 NEST12 孔儲液槽和1個PCR 孔板。

引物：疾病控制與預(yù)防中心(CDC)的引物和探針：

2019-nCoV_N1-F(GACCCCAAAATCAGCGAAAT)
2019-nCoV_N1-R (TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG)
2019-nCoV_N1-P(FAM-
ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1)
2019-nCoV_N2-F(TTACAAACATTGGCCGCAAA)
2019-nCoV_N2-R(GCGCGACATTCCGAAGAA)
2019-nCoV_N2-P(FAMACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1)
RP-F(AGATTTGGACCTGCGAGCG),
RP-R(GAGCGGCTGTCTCCACAAGT)
RP-P (FAM-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1)

CDC 引物和探針訂購自從Integrated DNA Technologies公司，又名IDT (2019-nCoV CDC EUA試劑盒)。N1、N2 和RNase P以CDC 推薦的濃度進(jìn)行預(yù)混。
16s 引物：
Forward (CCTATAAGACTGGGATAACTTCGGG)
Reverse (CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCG)
16s 引物從IDT 訂購，于IDTE 1XTE 溶液 pH:8.0(DT) 中重懸，稀釋至10uM 的工作濃度。

定量測量： DNA 和 RNA 樣本的濃度可以使用 Qubit 4.0 FluorometerM(Thermo Fisher)進(jìn)行定量測量。

此外，所有樣品均在 PCR max ECO48 實時 PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行 qPCR 定 量。RNA 樣品使用Luna°通用探針一步式 RT-qPCR 試劑盒(NEB) 進(jìn)行 測試，濃度由 Lista 、Maria Jose 等人測試(3)。 進(jìn)行以下程序：在 55℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄10分鐘。初始變性在95℃下進(jìn)行1 分鐘，然后進(jìn) 行50個循環(huán)，即在95℃下變性10秒，并在60℃下退火30秒。使用 Luna Universal qPCR Master Mix (NEB)以制造商推薦的濃度對DNA樣 品進(jìn)行測試。使用以下程序：初始變性在95℃下進(jìn)行60秒，隨后變性和延伸分別在95℃和60℃下進(jìn)行15秒和30秒，持續(xù)40個循環(huán)。

實驗結(jié)果
通過 qPCR 和熒光計分析測量， OT-2 提取的核酸數(shù)量接 近，核酸樣品的 一 致性更高。

OT-2 經(jīng)過了符合EUA 標(biāo) 準(zhǔn) 的性能測試，可以與多種qPCR 核提取試劑盒 一 起使用。

使用九種常用的提取試劑盒處理人類唾液和植物乳桿菌細(xì)菌培養(yǎng) 物，并使用兩種常見的 qPCR 靶標(biāo)進(jìn)行 qPCR 分析： RNase P 用于 唾液樣本，16s 用于細(xì)菌樣本。使用六個試劑盒處理大腸桿菌培養(yǎng)物并使用熒光分析進(jìn)行分析。

產(chǎn)量通過qPCR 中的循環(huán)閾值(Ct) 和熒光計中所得的ng/μL進(jìn)行評估。 一致性則通過Ct值的變異系數(shù) (CV) 進(jìn)行評估。

Ct值反映了樣品跨過高于背景信號的閾值所需的復(fù)制周期量，因此 它們傳達(dá)了數(shù)量的倒數(shù)測量。對于這些目標(biāo)，在此類樣品中，25-35的 Ct 值較為可靠。

通過所有提取試劑盒進(jìn)行檢驗測試，使用OT-2自動化系統(tǒng)進(jìn)行核酸 提取純化可以得到具有較低CV 和可比產(chǎn)量的Ct值(見圖1和表2)。熟練的技術(shù)人員和OT-2返回的平均Ct值為25-35。

手動處理的CV 值為1.41-4.8, OT-2 的CV 值為1.2-2.6。熟練的技術(shù) 人員和OT-2提供了可比且一致的24-26 ng/μL的產(chǎn)量。這些結(jié)果表明， OT-2能夠在提高一致性和重復(fù)性的同時提供高產(chǎn)量。

在與新冠病毒相關(guān)的測試中，使用合成的 SARS-CoV-2 樣本和七種 常用的提取試劑盒進(jìn)行了qPCR。 我們使用了 SNM 中的人類基因組 DNA 作為內(nèi)部對照，使用CDC 的 SARS-CoV-2N1 和 N2 引物進(jìn)行定量分析，同時使用 CDC 的 RP 引物作為陽性對照。

這項測試旨在評估使用不同提取試劑盒在 OT-2 上進(jìn)行新冠病毒 qPCR 分析的性能。通過使用合成的 SARS-CoV-2 樣本以及內(nèi)部對 照和陽性對照，可以判斷 OT-2 在檢測病毒基因組的準(zhǔn)確性和可靠性。

對qPCR 性能的評估是基于 PCR 檢測緊急使用授權(quán) (EUA) 標(biāo)準(zhǔn)。 為了滿足 EUA 標(biāo)準(zhǔn)， 一個測試必須達(dá)到95%的擴(kuò)增效果，也就是說，在qPCR 中，95%的樣本必須產(chǎn)生可檢測的N1和N2信號。

在這種性能評估中，我們還對 qPCR Ct 值進(jìn)行了評估。對于這些目標(biāo)，在這類樣本中，標(biāo)準(zhǔn) Ct值應(yīng)該在30-40之間。

根據(jù)表格 3 的結(jié)果，OT-2 幾乎在所有試劑盒上的表現(xiàn)均通過了 EUA 標(biāo)準(zhǔn)。除了兩個由于裂解緩沖液過分粘稠導(dǎo)致妨礙了提取過程 的試劑盒只有91%的測試結(jié)果合格。并且，所有被測試的試劑中， 樣品結(jié)果均實現(xiàn)了31-39的標(biāo)準(zhǔn) Ct 值。這些結(jié)果表明，OT-2 系統(tǒng)可以與各種品牌的試劑配套使用，并達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)。

為了測試OT-2 系統(tǒng)的吞吐量和速度，我們使用了13種熱門試劑盒 進(jìn)行了RNA 和DNA 提取，并覆蓋了不同長度。為了全面評估不同吞 吐量下的速度，測試了每批8、24、48和96個樣本的情況。以從原始樣品到純化核酸所需的時間來衡量實驗結(jié)果。

在這些提取試劑方案中，OT-2 系統(tǒng)在各種試劑盒和長度下實現(xiàn)了 快速提取的結(jié)果。在最短的協(xié)議中，處理8 個樣本只需要25 分 鐘，在最長的協(xié)議中，處理96個樣本不到5小時(圖2)。對于8 個樣本的處理時長， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時間為52分 鐘。而在96個樣本的情況下， OT-2 在13種試劑盒中平均處理時間 為2小時45分鐘。這些結(jié)果表明， OT-2系統(tǒng)可以將其高性能與高吞吐量相結(jié)合，顯著改善提取工作流程。

研究思考
OT-2 核酸提取工作站從有機(jī)和合成原始模板中提供了優(yōu)質(zhì)的 RNA 和 DNA 樣品。通過 qPCR 和熒光測試發(fā)現(xiàn)，該自動化系統(tǒng)產(chǎn)生的 產(chǎn)出與由高技術(shù)水平操作人員執(zhí)行的手動結(jié)果相當(dāng)，并且在實驗復(fù) 現(xiàn)率和精確性方面超過了手動操作的性能。研究表明，OT-2 成功 地達(dá)到了滿足緊急使用授權(quán) (EUA) 標(biāo)準(zhǔn)級別性能的要求， qPCR 信號檢測的成功率超過了95%。時間測試顯示，OT-2 處理8個樣 品的時間不到1小時，對于96個樣品的處理時間不到3 小時，這 是針對具有不同協(xié)議長度的試劑盒的平均值。事實上，使用最快的 試劑盒，OT-2 處理8個樣品只需要25分鐘，處理96個樣品僅需1個半小時。

應(yīng)用總結(jié)
●對于中等通量的實驗室來說，光是節(jié)省的時間就足以讓OT-2
在不到6個月的時間內(nèi)回本。

●OT-2每次處理24個樣品的提取可節(jié)省3.5小時的人工操作時 間。與手動操作相比，更高的吞吐量帶來更好的精確性、減少
的變異性和提高的可重復(fù)性。

●這種高性能可以促進(jìn)更好的質(zhì)量控制，減少下游數(shù)據(jù)的變異 性。此外，消除了繁瑣的人工操作程序可以減少錯誤，并降低
因為使用昂貴試劑重復(fù)運行程序而產(chǎn)生的成本。

這些測試都是在具有臨床和實驗室意義的多個樣品以及各種不同的提取試劑盒中進(jìn)行的。OT-2 的靈活性使其能夠適應(yīng)各種協(xié)議、試劑和樣本類型，以持續(xù)提供優(yōu)質(zhì)的結(jié)果。